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10x Genomics单细胞转录组测序在动物脑组织研究中的应用

发稿时间:2019-05-23来源:天昊生物


自从20171月发表的Nature Communications文章,首次基于10x Genomics平台对29样本的约25万个细胞进行大规模单细胞RNA测序(scRNA-seq)以来,利用该平台针对人类和动物不同组织和发育过程,发表的单细胞转录组测序高分文章便出现爆发式增长,今天就跟大家梳理一下10x Genomics单细胞RNA测序在小鼠、果蝇、斑马鱼动物脑组织研究中的应用。

 

1A Single-Cell Transcriptome Atlas of the Aging Drosophila Brain

题目:果蝇大脑老化单细胞转录组图谱

发表杂志:Cell 影响因子:31.398  发表日期:2018-8-9

 

 

研究内容:

通过对成年果蝇大脑单细胞图谱检测,确定了神经元和神经胶质细胞类型及其在衰老过程中的动态变化情况。

实验材料:

所有果蝇在25?C12h/12h光照周期的酵母培养基上饲养。在老化实验中,每个小瓶中放入20只雌性和10只雄性果蝇,每4天将果蝇转移到新的小瓶中。成年果蝇在01369153050天大时被使用。

实验方法:

大脑单细胞分离

40只果蝇大脑(20只雌性和20只雄性)解剖并转移到含有冰冷DPBS溶液的试管中。离心5分钟后,上清液被dispasecollagenase替换。大脑在25?C中以1000/分钟速度解离2h。用冰冷的DPBS溶液洗涤细胞,并在DPBS BSA中再悬浮30-40个大脑。细胞悬液通过pluriStrainer (ImTec Diagnostics_435001050)仪器。细胞活力和浓度由LUNA-FL双荧光细胞计数器评估。

分离后的单细胞进行后续10x Genomics单细胞分选。此外,本研究还用到了免疫荧光、ATAC-seq、细胞核分离、Bulk RNA-seqSMART-Seq2和CEL-Seq2等方法。

 

实验结果:

1)成年果蝇大脑scRNA-seq及细胞类型鉴定

本研究使用10x Genomics平台,对8个不同时间点的果蝇成年大脑单细胞进行分选测序。最终获得56902 (57K)个高质量细胞数据(DGRP-55129K个细胞,w111828K个细胞)。在所有细胞中检测到的基因总数为12436个蛋白质编码基因和2164个非编码核糖核酸。每个细胞的基因中值在1308 (0)810 (50)之间。根据分辨率的不同,对细胞进行聚类得出87–151个细胞聚类(1)。

研究者通过名为SCope的在线资源提供所有集群信息和每个集群的标记。使用两种方法将细胞群与已知的细胞类型联系起来,包括a将每个细胞群的识别标记与先前公布的已知细胞类型的标记基因进行比较的方法,以及b)将单细胞群中的基因表达与之前发表的果蝇大脑亚群转录组进行比较,通过回归模型拟合获得高度相似性细胞簇。

 

 

1、单细胞RNA测序鉴定的成熟果蝇大脑细胞类型分析(57000个脑细胞t-SNE图)

2)利用靶向细胞分选和亚聚类鉴定稀有细胞类型

为了鉴定未标记的细胞簇并将它们映射到特定的神经元群体上,利用已知的Gal4系可用于在特定的细胞群体中表达绿色荧光蛋白,进行FAC(荧光激活细胞)分选和分析,通过CEL-Seq2SMART-Seq2方法检测出更多基因,并成功对细胞类型进行了鉴定。

3)利用SCENIC绘制细胞类型特异性调控网络

研究者对鉴定的细胞类型所具有的特定基因调控网络和转录因子活性特征进行了分析,为此开发了SCENIC数据库,并发现了150个转录因子识别基序在共表达的基因集中显著富集。与Seurat相比,使用这些基因网络(而不是单独的基因表达)的细胞聚类产生了不同的t-SNE投影。结果表明,大量神经元具有共同的调节状态。

4)中枢大脑的调节状态可以预测氧化磷酸化水平

研究者通过探索调节子活性矩阵的PCA进一步研究了SCENIC t-SNE。结果表明,基于推断的基因调控网络的细胞聚类可以对神经元进行分组。为了探讨这种细分是否反映了功能差异,本研究评估了三个神经元组之间的差异基因表达谱,然后进行GO富集分析,并通过对线粒体翻译相关基因分析最终表明,衰老影响基因丰度。然而细胞类型保持不变。参与氧化磷酸化和线粒体周转的基因下降最快。

5SCope:基于云的单细胞细胞图谱工具

研究者最后开发了一个用户友好的在线应用工具SCope (http://scope.aertslab.org)。提供了果蝇、小鼠及人类等脑细胞单细胞数据集。

 

2Comprehensive Identification and Spatial Mapping of Habenular Neuronal Types Using Single-Cell RNA-Seq

题目:单细胞RNA测序对缰核神经元类型的综合识别和空间定位

发表杂志:Current Biology 影响因子:8.851  发表日期:2018-4-2

 

 

 

 

研究内容:

本研究使用scRNA-seq来鉴定了幼年和成年斑马鱼缰核中不同的神经元类型。

实验材料:

幼年和成年斑马鱼生长在25?C12h/12h光照周期环境中。在实验中使用受精后10天的幼年仔鱼和1岁左右的成年雄性和雌性斑马鱼。

实验方法:

10x Genomics相关细胞分离和文库制备

解剖来自25gng8-GFP鱼的头部,分离细胞如前所述。将大约6000-8000个细胞立即分选到20微升PBS中。分选是用贝克曼MoFlo Astrios超高速流式分选系统进行的,分选压力在20psi。这是一个关键的步骤,因为更高的分选压力导致分选后过量的细胞死亡。所得单细胞悬液被迅速装载到10x Genomics系统中。分选后的细胞在冰上保存不超过10分钟,因为通过台盼蓝染色测量的细胞生存力随时间下降。

对于成年鱼的实验,基于gng8-GFP标记的表达,将6个成年缰核直接从大脑中解剖出来。木瓜蛋白酶酶解后,将所得细胞在PBS+BSA中洗涤一次,并通过20微米细胞过滤器过滤。然后重悬细胞后在血细胞计数器上计数。通过台盼蓝染色评估细胞活力,并在确保悬浮细胞活力大于80%后,将细胞以约300细胞/微升的浓度装载到10x Genomics系统中。10x Genomics文库构建根据厂商说明进行。

SMART-seq2相关细胞分离及文库制备

幼鱼头部解剖切割后,使用Papain Dissociation Kit迅速解离,酶解后将细胞重新悬浮在EBSS溶液中。得到的细胞悬液通过20微米细胞过滤器并置于冰上。加入两种活力指示剂(calcein blue活细胞染色剂和ethidium homodimer死细胞染色剂)。如果通过calcein blue染色测量的细胞存活率大于85%,则立即将细胞直接分选到含有裂解缓冲液的96孔板中。所有样品立即冷冻在干冰中,并储存在-80℃直至进一步处理。

为了制备SMART-seq2文库,将含有单细胞裂解物的平板在冰上解冻,用beads纯化。然后将beads风干并迅速加工用于合成cDNASMART-seq2文库使用常规方法进行。

实验结果:

1斑马鱼幼体单神经元的分离和转录谱分析

由于scRNA-seq以前没有应用于斑马鱼神经元,本实验设计并优化了一个从斑马鱼大脑中分离和捕获单个神经元的方案。实验发现,成功的实验需要温和的研磨,减少解离后的处理时间,以及荧光激活细胞分选(FACS)过程中最小的分选压力。实验使用gng8-GFP转基因系对缰核细胞进行分类,该转基因系选择性地标记缰核中的大多数神经元(图1)。

 

1scRNA-Seq数据的无偏聚类确定了幼体缰核中15个分子不同的神经元簇

使用两个互补的scRNA-Seq平台(1B(1)基于大规模平行液滴的3scRNA-Seq (商业10x Chromium平台)(2)低通量基于平板的全长scRNA-Seq (SMART-Seq2)。使用基于液滴的scRNA-seq4365个幼体细胞中获得数据,使用SMART-seq2(以下简称SS2数据集)1152个幼体细胞中获得数据。尽管斑马鱼神经元中的核糖核酸水平很低,本实验平均检测到1350(液滴法)3850 (SS2)个基因/细胞。因此,多个scRNA- seq平台可以有效地应用于斑马鱼大脑中的神经元。

2)鉴定了15个转录上不同的聚类簇

在幼体缰核中,为了识别神经元类型使用了液滴数据集法。在4233个过滤细胞中获得13160个基因的基因表达矩阵。对1436个可变基因的基因表达矩阵进行了PCA分析,鉴定出36个具有统计学意义的主成分。这些计算机被用来建立细胞的k最近邻图,然后使用算法将其划分为14个转录不同的聚类,并用t-分布随机邻域嵌入(t-SNE)将所得的16个聚类二维可视化(1C),并评估差异基因表达以鉴定聚类特异性标记(1D)

3)大多数先前描述的特异性基因在多个神经元簇中广泛表达

为了理解我们的簇特异性标记如何与先前描述的缰核基因相关,本研究发现了三种基因表达模式。首先,一些已知基因显示出与单个簇几乎完全重叠,并且通过我们的分析也独立地被鉴定为簇特异性标记。其次,一些已知标记缰核背侧亚结构域的基因跨越了几个簇。第三,大多数先前报道的缰核内区域表达模式的基因在多个簇。通过核糖核酸荧光原位杂交(FISH)验证了这些经典标记与多个簇的重叠,证明了据报道空间受限的单个基因可以跨越多个神经元亚型。

此外,本研究对幼年和成年之间神经元类型的保留进行了探讨,成功构建了相关单细胞基因表达图谱。

 

3Single-Cell Transcriptomics Analyses of Neural Stem Cell Heterogeneity and Contextual Plasticity in a Zebrafish Brain Model of Amyloid Toxicity

题目:斑马鱼淀粉样蛋白毒性脑模型神经干细胞异质性和上下文可塑性的单细胞转录组学分析

发表杂志:Cell Reports 影响因子:8.032  发表日期:2019-4-23

 

 

 

研究内容概述

斑马鱼大脑通过产生更多来自神经干细胞的神经元来对抗阿尔茨海默病。本研究通过使用单细胞测序技术,在成年斑马鱼大脑中识别出对阿尔茨海默病样症状有不同反应的不同干细胞群,并开发出研究其分子机制的程序工具。

实验材料:

表达GFP的转基因斑马鱼用于分选祖细胞和端脑的其余部分。受精后6个月的雌鱼用于分析。

实验方法:

10x Genomics scRNA-Seq

实验结论:

 

1、斑马鱼脑细胞分选和细胞类型归类

1)单细胞转录组学揭示斑马鱼神经干细胞/神经胶质的异质性

2)不同的干细胞群可以在空间和分子层面上定义

3Amyloid-b-42和白细胞介素-4诱导某些祖细胞群体的可塑性

4)相互作用图谱预测调节神经干细胞可塑性的途径

 

4Developmental Diversification of Cortical Inhibitory Interneurons

题目:皮层抑制中间神经元的发育多样化

发表杂志:Nature 影响因子:41.577  发表日期:2018-5-22

 

 

研究内容概述

皮质中间神经元的不同子集在高阶大脑功能中起着至关重要的作用。为了研究这种多样性是如何产生的,本研究使用scRNA-Seq来描述在发育过程中的小鼠脑细胞转录组。

实验材料:

野生型和转基因雄性及雌性小鼠。

实验方法:

10x Genomics scRNA-SeqSMART-seq2等。

实验结果及结论:

神经节突起中有丝分裂祖细胞的异质性是由高度保守的成熟轨迹驱动的,同时突起特异性转录因子的表达孕育了后来多样性的出现。在有丝分裂后,祖细胞分化并分化成转录上不同的状态,包括中间神经元前体状态。通过跨发育时间点整合数据集,发现了成体中间神经元及其前体之间转录组异质性的共同来源,并揭示了主要中间神经元亚型的胚胎出现。本研究分析显示,转录因子Mef2c与各种神经精神和神经发育障碍相关,描述了表达细小白蛋白的神经元的早期前体,对其发育至关重要。这些发现为早期抑制前体的分子多样性提供了新的线索,并确定了可能影响人类中间神经元亚型的基因模块。

 

1、小鼠神经节单细胞转录组测序图谱

 

5A Single-Cell Transcriptional Atlas of the Developing Murine Cerebellum

题目:发育中的小鼠小脑单细胞转录图谱

发表杂志:Current Biology 影响因子:8.851  发表日期:2018-9-24

 

研究内容概述

小脑由数量有限的细胞类型发展而来,这些细胞类型精确地组织形成控制感觉-运动协调和一些高阶认知过程。本研究创建了发育中的鼠小脑单细胞转录图谱,由来自12个时间点的39245个细胞组成。主要小脑谱系被鉴定,已知的和新的假定转录调节因子也被鉴定。数据集被集成到基于网络界面Cell Seek中用于交互式探索。

实验材料与方法:

对小鼠发育过程12个时间点小脑组织进行分离。这些时间点包括小鼠出生前每天间隔的八个e10e17胚胎时间点以及出生后的P0P4P7P10四个时间点的脑组织样本。对于胚胎时间点,同一窝的小脑在每个实验中被组合,而出生后的时间点每窝只使用一只幼鼠。每个时间点使用两个独立的重复进行。小脑在木瓜蛋白酶溶液中解离30分钟,在Neurobasal中冲洗,并用40微米过滤器过滤。细胞用0.4% BSAPBS中重悬。用LUNA自动细胞计数器对用Acridine Orange/Propidium Iodide染色的细胞浓度和生存力进行评估,之后进行标准的 10x Genomics scRNA-Seq检测分析。

 

实验结果及结论:

本研究在12个关键发育时间点对39245个小鼠小脑细胞进行了scRNA-Seq。使用公认的谱系标记,证实单细胞数据准确地概括了小脑的发育。然后通过迁移和分化跟踪不同群体的出现,并确定相关的转录级联。在确定关键谱系承诺决策后,集中分析揭示了在这些分支点转录因子表达的波动。最后,创建了Cell Seek,这是一个灵活的在线界面,有助于数据集的探索。本研究提供了单细胞分辨率下小脑发育的转录总结,这将为小脑发育、神经生物学和疾病的未来研究提供有价值的资源。

 

 

 

关于天昊

天昊生物具有多年基因组、转录组和表观组检测与分析经验,现推出的10x单细胞转录组测序可为您提供专业便捷的科研服务及个性化的单细胞信息挖掘,期待成为您单细胞测序分析的优质服务提供商!

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